Was ist die SDS-PAGE-Gelpolymerisationszeit?

Es gibt nichts Besseres als eine allgemeine Polymerisationszeit, da es sich um eine chemische Reaktion handelt, die von vielen Faktoren abhängt. Die wichtigsten sind:

APS: Konzentration und Alter der Chemikalie sind wichtig. APS zersetzt sich im Laufe der Zeit, wenn es nicht vollständig trocken gelagert wird (was auf den meisten Werkbänken nicht der Fall ist) und auch bei Gefrier-Auftau-Zyklen bei der Lagerung. APS liefert die für die Reaktion notwendigen freien Radikale; ohne sie findet keine Polymerisation statt. Meiner Erfahrung nach ist APS der kritischste Teil der Reaktion, da alte Lösungen die Polymerisation sehr langsam machen. Ich würde eine Stammlösung herstellen und sie in Aliquots einfrieren. Zur Herstellung von Gelen taue ich ein Aliquot auf und bewahre es danach eine Woche im Kühlschrank auf und entsorge es dann.

TEMED: Ist der Katalysator für die Reaktion, zu viel davon wird die Reaktion sehr schnell starten.

Temperatur: Je wärmer es ist, desto schneller erfolgt die Polymerisation. Im Kühlraum erhalten Sie, wenn überhaupt, keine vollständige Reaktion.

Was Sie tun können, ist, das restliche Acrylamid im Becherglas aufzubewahren und zu warten, bis es polymerisiert ist. Dann sollte Ihr Gel auch in Ordnung sein. Eine längere Polymerisationszeit (vorausgesetzt, Ihr Gel war zuvor vollständig polymerisiert) ändert nichts an der Auflösungskapazität Ihres Gels.

Andere haben bereits die Auswirkung verschiedener Faktoren auf die Polymerisationszeit erklärt. Bei dieser Antwort geht es hauptsächlich um:

Wenn ich die Zeit erhöhe, würde es dann das Bandmuster beeinflussen?

Es kann.

Einige Hinweise:

• Machen Sie ein wenig zusätzliche Mischung, damit Sie etwas im Becherglas lassen können, um zu wissen, ob eine Polymerisation stattgefunden hat.
• Das gegossene Auflösungsgel immer mit Wasser überschichten, damit das Gel nicht eintrocknet.
• Lassen Sie das Gel nach der Polymerisation nicht lange stehen. Dies ist nicht nur Zeitverschwendung, sondern kann auch dazu führen, dass das Gel austrocknet und SDS/Harnstoff ausfällt/kristallisiert.
• Waschen Sie die Gele mit dem Laufpuffer, nachdem Sie den Kamm entfernt haben/bevor Sie die Probe laden. Sie können dazu eine feine Nadel (hohe Stärke) verwenden.
• Führen Sie das Gel vor, um es ins Gleichgewicht zu bringen; Dies ist im Allgemeinen nicht erforderlich und würde, wie Nick Sandor sagte, das Stapelgel zerstören. Es ist jedoch wichtig für große Harnstoffgele und etwas wichtig für kontinuierliche SDS-Gele, wenn Sie es längere Zeit nach der Polymerisation belassen haben. Daher ist es besser, das Gel nicht lange stehen zu lassen

Die Polymerisationszeit ist stark von der APS- und TEMED-Konzentration abhängig. Ich glaube nicht, dass die verlängerte Polymerisationszeit die Teilung der Proteine ​​irgendwie negativ beeinflussen würde. Tatsächlich variiert die Zeit zwischen 20 min und 1 h, aber ich persönlich lasse das Gel länger polymerisieren. Unpolymerisiertes Acrylamid könnte mit einigen Proteinen Addukte bilden, die zu mehreren Banden führen könnten. Außerdem ist Acrymamid selbst giftig, daher gebe ich ihm immer zusätzliche Zeit zum Polymerisieren. Viel Glück!

APS- und TEMED-Konzentrationen sind sehr wichtig. Selbst mit dieser Standardisierung verliert Ihr Polyacrylamid im Regal reaktive Gruppen, während wir hier sprechen. Wer weiß, wie lange es im Lager lag? Das alles summiert sich dazu, dass die minimal benötigte Zeit praktisch nicht vorhersehbar ist.

Andererseits ist ein einmal polymerisiertes Gel tagelang ohne sichtbaren Qualitätsverlust stabil. Die Polymerisation über Nacht ist "optimal" in dem Sinne, dass das Gel bei längerer oder kürzerer Polymerisation nicht besser wird. Aber das gilt auch für ein zwei Tage altes Gel. Früher gossen die Leute jeden Freitag Gele und ließen sie für die nächste Woche in nassen Papiertüchern im Kühlraum liegen.