Wie verursacht NHEJ Indels?

Das ist eine sehr interessante Frage, über die ich vorher noch nicht nachgedacht hatte. Ich wiederhole den Hintergrund Ihrer Frage.

Hintergrund

Cas9 schneidet beide Stränge der Ziel-DNA an der gleichen Stelle, wodurch ein stumpfer Endschnitt entsteht. Üblicherweise führen klebrige Enden und mikrohomologe Enden aufgrund von exonukleolytischem Abschneiden und Hinzufügen zusätzlicher Basen durch pol-µ zu Indels. Die Frage ist, wie Indels während der NHEJ-vermittelten Religierung von stumpfen Enden entstehen.

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NHEJ führt möglicherweise nicht immer zu Indels. Die meisten stumpfen Endschnitte können ohne Fehler repariert werden. Einige nicht stumpfe Schnitte werden auch perfekt religiert; bestes Beispiel dafür ist die VDJ-Rekombination. Die Bindung von Ku-Proteinen ist essentiell für eine perfekte Religation (kanonische NHEJ/C-NHEJ).

Es gibt jedoch einige abweichende nicht-kanonische Wege, darunter Alternative-NHEJ, Backup-NHEJ und Microhomology Mediated End Joining (MMEJ) ( Bétermier et al. 2014 ). Einige Studien bezeichnen alle diese Wege auch als alternative NHEJ oder altNHEJ. Diese alternativen Wege umfassen die Resektion von Nukleotiden durch Exonukleasen wie Mre11, um Überhänge zu erzeugen. Eine unvollkommene Ausrichtung dieser Überhänge vor der Ligation führt zu Indels. Manchmal erfolgt die Nicht-Matrizen-Addition von Nukleotiden durch die Wirkung der terminalen Desoxyribonuclotid-Transferase (TdT). Pol-µ kann auch zufällige Nukleotide am 3'-Ende hinzufügen ( Lieber 2010 ).

Im Allgemeinen wäre die Neigung zu DSBR über alternative NHEJ-Wege höher, wenn die Ku-Aktivität geringer ist. Selbst bei einer moderaten Ku-Aktivität besteht immer eine gewisse Wahrscheinlichkeit, dass alternative Wege in Aktion treten. Darüber hinaus ist anzumerken, dass Ligationen mit klebrigen Enden effizienter sind als Ligationen mit stumpfen Enden.

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^{Reproduziert von Bétermier et al. 2014}