Anscheinend ist es möglich, anhand der Diagramme der Substratkonzentration (x-Achse) und der Reaktionsgeschwindigkeit (y-Achse) zu erkennen, ob ein Inhibitor kompetitiv oder nicht kompetitiv ist.
Es muss eine Zeile für mit Inhibitor (konstante Konzentration) und ohne Inhibitor geben. Der Unterschied bei und kann dann interpretiert werden, um herauszufinden, ob der Inhibitor kompetitiv ist oder nicht.
Ich weiß, dass, wenn die Wirkung des Inhibitors mit zunehmender Substratkonzentration abnimmt, der Inhibitor kompetitiv ist.
Ich verstehe jedoch nicht, wie ich dies anhand der zuvor erwähnten Grafiken erkennen soll und . Könnte jemand erklären.
Ich habe versucht, dies zu googeln, aber das meiste, was auftaucht, sind wissenschaftliche Artikel, die mein Verständnis übersteigen ...
Ich denke, es ist möglich, die Art der Hemmung aus den Kurven der (Anfangs-)Geschwindigkeit gegenüber den Substratkonzentrationskurven zu identifizieren , aber es ist schwierig. Üblicherweise geschieht dies durch eine lineare Transformation der Michaelis-Menten-Gleichung, wie z. B. das Lineweaver-Burk- Diagramm.
Aber Sie haben Recht: Bei einem reversiblen Inhibitor besteht der Weg zur Identifizierung des Hemmungsmusters (d. h. zur Bestimmung, ob ein reversibler Inhibitor kompetitiv, nicht kompetitiv, gemischt oder nicht kompetitiv ist ) darin, die Änderungen der kinetischen Konstanten zu untersuchen (normalerweise K m und V max , aber siehe unten)
Bevor wir uns damit befassen, wie das gemacht wird, gibt es ein paar Punkte, die wir beachten müssen.
1. Reversible Inhibitormuster
Wir können nun unsere Hemmungsmuster unabhängig von einem Mechanismus, der sie hervorruft , wie folgt definieren:
Ein kompetitiver Inhibitor hat keine Auswirkung auf V max , senkt aber den scheinbaren Wert von V max /K m . Wir können auch in der „alten Schule“ sagen, dass ein kompetitiver Inhibitor keine Wirkung auf V max hat , aber den scheinbaren K m -Wert erhöht. Oder wenn wir die Dinge in Form von Lineweaver-Burk- Plots „visualisieren“ (siehe diesen Wikipedia-Artikel ), können wir sagen, dass ein kompetitiver Inhibitor keine Auswirkung auf V max hat , aber den scheinbaren Wert von K m /V max erhöht
Ein nicht kompetitiver Inhibitor verringert den scheinbaren Wert von V max , hat aber keine Auswirkung auf V max /K m . Oder, in Begriffen von Reziprokwerten gedacht, erhöht ein nicht kompetitiver Inhibitor den scheinbaren Wert von 1/Vmax, hat aber keine Wirkung auf Km / Vmax . „Nicht wettbewerbsfähig“ ist in vielerlei Hinsicht ein sehr schlechter Begriff. Cornish-Bowden (2004) schlägt den Begriff „katalytischer Inhibitor“ vor, und Laidler und Bunting verwenden den Begriff „wettbewerbswidrig“, um diese Art der Hemmung zu beschreiben.
Da haben wir es also: Die beiden Fälle, die reversible Hemmung "abgrenzen", sind Fälle, in denen nur die scheinbare V max geändert wird (nicht kompetitive Hemmung) und in denen nur die scheinbare V max /K m (die Spezifitätskonstante) geändert wird (kompetitive Hemmung). Bei einer „gemischten“ Hemmung werden die scheinbaren Werte dieser beiden kinetischen Konstanten beeinflusst, und ein Sonderfall der „gemischten“ Hemmung liegt vor, wenn die scheinbaren Werte beider kinetischen Konstanten im gleichen Maße verringert werden, was zu keiner Änderung der Michaelis führt Konstante.
2. Reversible Inhibitormechanismen
Bisher habe ich nichts über die Mechanismen gesagt, die zu diesen Hemmungsmustern führen könnten. Vorrunde:
(a) Wettbewerbshemmung
Betrachten wir die reversible Hemmung in einem Einzelsubstrat-Enzym, die durch den oben gezeigten Mechanismus beschrieben wird, bei dem sowohl der Inhibitor als auch das Substrat um das "freie" Enzym konkurrieren.
Die Ableitung des Geschwindigkeitsgesetzes für diesen Mechanismus unter Verwendung entweder der Gleichgewichts- oder der Steady-State -Annahme führt zu einer Gleichung der folgenden Form (schöne Ableitungen finden sich in Segel , 1975):
Repräsentative Diagramme von Gleichung (1), die die Wirkung steigender Inhibitorkonzentrationen zeigen:
Das Bilden von Kehrwerten von Gleichung (1) gefolgt von einer Umordnung führt zur linearen Lineweaver-Burk-Transformation:
Es ist sofort ersichtlich, dass der Inhibitor den scheinbaren Wert von erhöht / aber wirkt nicht 1 / .
Das heißt, es beeinflusst die Spezifitätskonstante ( / ) aber nicht . Die Hemmung ist daher kompetitiv
Diagramme von Gleichung (2) sagen eine Schar gerader Linien voraus, die sich auf der y-Achse bei schneiden / , und das kompetitive Hemmungsmuster ist leicht zu erkennen:
In Bezug auf die Lineweaver-Burk-Transformation bewirkt ein kompetitiver Inhibitor, dass die Steigung zunimmt, ändert aber nicht den Schnittpunkt der y-Achse .
Wir können auch noch einen Schritt weiter gehen. Die Steigungen der obigen Linien sind durch die folgende Gleichung gegeben:
Daher wird vorhergesagt, dass ein Diagramm der Steigung gegen die Inhibitorkonzentration eine gerade Linie ist, die die x-Achse bei – schneidet.
Solche Replots erfüllen zwei Funktionen. Erstens ermöglichen sie die Bestimmung der Wert. In diesem Fall beträgt der Schnittpunkt der x-Achse -100, was nicht allzu überraschend ist, da 100 der Wert von war in der Simulation gewählt. Zweitens prüfen sie auf unerwartete kinetische Komplexität. Beispielsweise könnte ein Replot mit gekrümmter Steigung auf eine teilweise kompetitive Hemmung hinweisen, bei der der EI-Komplex möglicherweise zusammenbrechen kann, um ein Produkt zu ergeben. Eine solche kinetische Komplexität ist wahrscheinlich selten bei Einzelsubstratenzymen, kann aber bei Multisubstratenzymen auftreten (und kann die Ablehnung eines einfachen kinetischen Mechanismus als Erklärung für kinetische Daten erfordern). Segel (1975) geht sehr stark auf die partielle Hemmung und die Mechanismen ein, die sie hervorrufen können. Wenn der Steigungs-Replot linear ist, können wir von einer linearen kompetitiven Hemmung sprechen (siehe Cornish-Bowden, 2004).
Zur Wettbewerbshemmung kann eine Reihe von Punkten angeführt werden:
Lassen Sie uns abschließend diesen Punkt wiederholen: Gleichung (1) beschreibt einen Mechanismus, der zu einem kompetitiven Hemmungsmuster führt . Es ist sicherlich nicht das einzige.
(b) Nicht kompetitive Hemmung
Betrachten wir nun einen Mechanismus, der durch das obige Diagramm beschrieben wird, bei dem der Inhibitor nicht an das "freie" Enzym binden kann, sondern stattdessen an den Enzym-Substrat-Komplex bindet (um einen fehlgeschlagenen ternären EAI-Komplex zu ergeben).
Die Ableitung des Geschwindigkeitsgesetzes und seines Mechanismus (wiederum entweder unter Annahme des stationären Zustands oder des Gleichgewichts; siehe Segel, 1975) führt zu einer Gleichung der folgenden Form:
Umwandlung in die Lineweaver-Burk -Form:
In diesem Fall erhöht der Inhibitor den scheinbaren Wert von 1 / wirkt aber nicht /
Mit anderen Worten, es beeinflusst den scheinbaren Wert von , hat aber keinen Einfluss auf die Spezifitätskonstante ( / ). Die Hemmung ist daher nicht kompetitiv .
Darüber hinaus hebt im Gegensatz zur kompetitiven Hemmung die Erhöhung der Substratkonzentration die Hemmung nicht auf.
Ein nicht kompetitiver Inhibitor bewirkt, dass die Steigung eines Lineweaver-Burk-Diagramms zunimmt, ändert jedoch nicht den y-Achsenabschnitt eines solchen Diagramms .
Daher doppelt-reziproke Plots von / vs / Bei verschiedenen bilden eine Schar paralleler Linien .
In diesem Fall ist die kann aus einem Intercept-Replot bestimmt werden, wobei der X-Achsen-Intercept - .
(c) Gemischte Hemmung
Betrachten wir nun einen Mechanismus, bei dem der Inhibitor entweder an das „freie“ Enzym oder den Enzym-Substrat-Komplex binden kann und (um die Dinge einigermaßen realistisch zu halten), bei dem das Substrat entweder an das freie Enzym oder den Enzym-Inhibitor-Komplex binden kann.
Unter bestimmten vereinfachenden Annahmen (siehe Segel, 1975) kann der oben gezeigte Mechanismus zu folgendem Geschwindigkeitsgesetz führen:
In diesem Fall gibt es zwei Hemmungskonstanten, von denen eine die Bindung des Inhibitors an das „freie“ Enzym „regelt“ ( ) und eine, die die Bindung des Inhibitors an den Enzym-Substrat-Komplex ( ).
Wenn man Kehrwerte nimmt, kann die entsprechende Lineweaver-Burk-Transformation wie folgt ausgedrückt werden:
Der Inhibitor erhöht sowohl scheinbar den Wert von 1 / und (nicht unbedingt derselbe Faktor) und der scheinbare Wert von / . Die Hemmung ist daher gemischt .
Gleichung (7) sagt eine Schar von geraden Linien voraus, die sich in einem einzigen Punkt schneiden:
In diesem Fall können Neigungs- und Schnittpunkt-Wiederholungen verwendet werden, um die Werte von zu bestimmen und . Eine detaillierte Analyse solcher Plots findet sich in Segel (1975).
(d) Nicht-kompetitive Hemmung
Wir kommen nun zum Fall der nicht-kompetitiven Hemmung, die (wie oben erwähnt) am besten als Sonderfall der gemischten Hemmung betrachtet werden kann. Wann = , Gl. (6) vereinfacht sich zu:
Die Lineweaver-Burk- Transformation:
Gleichung (10) sagt eine Familie von Linien voraus, wo sie ansteigt beeinflusst sowohl die Steigung als auch den Achsenabschnitt in gleichem Maße, und die sich auf der x-Achse bei schneiden /
Aber warum sollte gleich in jedem realistischen Fall?
Anmerkungen
Fersht besitzt nun das Urheberrecht an seinem Buch und verteilt es kostenlos
Alle Ausgaben von Acta Chem Scand (1947–1999), einschließlich vieler klassischer Papiere, sind online verfügbar
Ein Beispiel für die Ableitung eines Steady-State-Ratengesetzes finden Sie in dieser Biology Stack Exchange-Antwort
Verweise
Cook, PF & Cleland , WW (2007). Enzymkinetik und Mechanismus. Garland Science Publishing (Taylor & Francis Group). London & NewYork.
Cornish-Bowden , A. (2004). Grundlagen der Enzymkinetik. 3. Aufl. Portland Press Ltd., London.
Dalziel, K. (1957). Steady-State-Anfangsgeschwindigkeiten bei der Bewertung von Enzym-Coenzym-Substrat-Reaktionsmechanismen. Acta Chem. Scannen. 11, 1706 - 1723. [ pdf ]
Dalziel, K. (1975). Kinetik und Mechanismus von Nicotinamid-Nukleotid-verknüpften Dehydrogenasen. In The Enzymes, 3. Aufl., Bd. 11. Boyer, PD, Ed. S. 1–60. Academic Press, New York.
Fernt, A. (1999). Struktur und Mechanismus in der Proteinwissenschaft. Ein Leitfaden zur Enzymkatalyse und Proteinfaltung. W. H. Freeman, New York. [ pdf ]
Li, T. - K. & Theorell, H. (1969). Alkoholdehydrogenase aus der menschlichen Leber: Hemmung durch Pyrazol und Pyrazol-Analoga. Acta Chem. Scannen. 23, 892 - 902. [ pdf ]
Lineweaver, H. & Burk, D. . (1934). Die Bestimmung von Enzymdissoziationskonstanten. Marmelade. Chem. Soc . 56, 658 - 666.
Segel , IH (1975). Enzymkinetik. Verhalten und Analyse von schnellen Gleichgewichts- und Steady-State-Enzymsystemen. John Wiley & Sons, Inc., New York.
Kompetitiver Inhibitor konkurriert um das aktive Zentrum. Daher stört es die Bindung des Substrats, wodurch die scheinbare K M erhöht wird .
Ein strikt nicht-kompetitiver Inhibitor konkurriert nicht um das aktive Zentrum. Es hemmt jedoch die Katalyse, indem es die verfügbaren Moleküle des aktiven Enzyms E 0 reduziert (wenn es ein perfekter Inhibitor ist), wodurch V max gesenkt wird .
Es kann auch gemischte Hemmstoffe geben und es kann verschiedene Arten von gemischten Hemmungen geben. Zum Beispiel ein Inhibitor, der in die Katalyse eingreift und auch um das aktive Zentrum konkurrieren kann.
Je nachdem, wie Sie K M definieren , kann ein nicht-kompetitiver Inhibitor es ändern oder nicht. Wenn ein solcher Inhibitor an das Enzym an der nicht-aktiven Stelle binden und seine k cat reduzieren kann , ändert er im Falle der Briggs-Haldane-Kinetik sowohl die KM als auch die V max .
David
Mirte