Identifizierung des Inhibitortyps aus KmKmK_m und VmaxVmaxV_{max}

Ich denke, es ist möglich, die Art der Hemmung aus den Kurven der (Anfangs-)Geschwindigkeit gegenüber den Substratkonzentrationskurven zu identifizieren , aber es ist schwierig. Üblicherweise geschieht dies durch eine lineare Transformation der Michaelis-Menten-Gleichung, wie z. B. das Lineweaver-Burk- Diagramm.

Aber Sie haben Recht: Bei einem reversiblen Inhibitor besteht der Weg zur Identifizierung des Hemmungsmusters (d. h. zur Bestimmung, ob ein reversibler Inhibitor kompetitiv, nicht kompetitiv, gemischt oder nicht kompetitiv ist ) darin, die Änderungen der kinetischen Konstanten zu untersuchen (normalerweise K _m und V _max , aber siehe unten)

Bevor wir uns damit befassen, wie das gemacht wird, gibt es ein paar Punkte, die wir beachten müssen.

• Das Folgende gilt nur für reversible Inhibitoren. Irreversible Hemmungen, wie die Hemmung der Acetylcholinesterase durch das Nervengas Sarin , werden anders behandelt . (Mit „reversibel“ ist einfach gemeint, dass, wenn der Inhibitor entfernt wird, beispielsweise durch Verdünnung, die Hemmung verschwindet). Darüber hinaus werden fest bindende Inhibitoren nicht berücksichtigt.
• Das Folgende gilt auch nur für Ein-Substrat-Enzyme, die der Michaelis-Menten-Gleichung gehorchen. (Aber die Analyse kann ohne allzu große Schwierigkeiten auf Multi-Substrat-Enzyme ausgedehnt werden).
• Wir müssen mit dem Begriff „nicht wettbewerbsorientiert“ sehr vorsichtig sein. Es bedeutet für verschiedene Menschen unterschiedliche Dinge. Es ist auch oft das uninteressanteste Hemmungsmuster.
• Bei der Analyse von Hemmungsmustern ist es oft einfacher , die Wirkung auf V _max und V _max /K _m (die Spezifitätskonstante) zu analysieren , statt auf K _m und V _max . Der Grund dafür ist, dass Km eine komplexe kinetische Konstante ist und (wie Dalziel und Fersht gezeigt haben) als das Verhältnis von _Vmax und der Spezifitätskonstante (Vmax _/ Km ₎ betrachtet werden sollte . In dieser Hinsicht haben Enzymkinetiker die Dinge "vermasselt", indem sie die Spezifitätskonstante als das Verhältnis der maximalen Geschwindigkeit und der Michaelis-Konstante betrachteten:es ist die Michaelis-Konstante, die das Verhältnis ist . Allerdings ist das Paradigma, die Spezifitätskonstante als V _max /K _m zu betrachten , mittlerweile so tief verwurzelt, dass ich dabei bleiben werde. Aber der „Trick“ bei der Analyse von Hemmungsmustern besteht darin, in Begriffen von V _max und V _max /K _m zu denken .
• Vieles von dem, was folgt, kann auch auf die reversible Aktivierung angewendet werden, aber ich werde überhaupt nicht darauf eingehen.

1. Reversible Inhibitormuster

Wir können nun unsere Hemmungsmuster unabhängig von einem Mechanismus, der sie hervorruft , wie folgt definieren:

• Ein kompetitiver Inhibitor hat keine Auswirkung auf V _max , senkt aber den scheinbaren Wert von V _max /K _m . Wir können auch in der „alten Schule“ sagen, dass ein kompetitiver Inhibitor keine Wirkung auf V _max hat , aber den scheinbaren K _m -Wert erhöht. Oder wenn wir die Dinge in Form von Lineweaver-Burk- Plots „visualisieren“ (siehe diesen Wikipedia-Artikel ), können wir sagen, dass ein kompetitiver Inhibitor keine Auswirkung auf V _max hat , aber den scheinbaren Wert von K _m /V _{max erhöht}

• Ein nicht kompetitiver Inhibitor verringert den scheinbaren Wert von V _max , hat aber keine Auswirkung auf V _max /K _m . Oder, in Begriffen von Reziprokwerten gedacht, erhöht ein nicht kompetitiver Inhibitor den scheinbaren Wert von 1/Vmax, _hat aber keine Wirkung auf _Km / _Vmax . „Nicht wettbewerbsfähig“ ist in vielerlei Hinsicht ein sehr schlechter Begriff. Cornish-Bowden (2004) schlägt den Begriff „katalytischer Inhibitor“ vor, und Laidler und Bunting verwenden den Begriff „wettbewerbswidrig“, um diese Art der Hemmung zu beschreiben.

• Ein gemischter Inhibitor verringert den scheinbaren Wert von Vmax _und verringert den scheinbaren Wert von _Vmax / _Km . Oder, in Begriffen von Kehrwerten gedacht, erhöht ein "gemischter" Inhibitor den scheinbaren Wert von 1/Vmax _und erhöht den scheinbaren Wert von _Km / _Vmax .
• Einen nicht-kompetitiven Inhibitor stellt man sich am besten als Sonderfall einer gemischten Hemmung vor, bei der die scheinbaren Werte von Vmax _und Vmax _/ Km _im gleichen Ausmaß verringert werden . Daraus ergibt sich eine interessante Konsequenz: Da die Michaelis-Konstante als das Verhältnis dieser beiden kinetischen Konstanten angesehen werden kann, bleibt sie bei nicht-kompetitiver Hemmung unverändert . Es ist jedoch schwierig, sich einen realistischen kinetischen Mechanismus vorzustellen, der zu dieser Art von Verhalten führt. Cornish-Bowden (2004, S. 118-119) ist in diesem Punkt sehr stark (es gibt auch eine vierte Auflage dieses großartigen Buches).
• Wir kommen jetzt zu einem "kniffligen" Teil. Einige Behörden, insbesondere Cleland , unterscheiden nicht zwischen „gemischter“ und „nicht kompetitiver“ Hemmung , sondern nennen stattdessen alle Fälle, in denen sowohl Vmax _als auch Vmax _/ Km _verringert sind, „nicht kompetitive Hemmung“ . Hier müssen wir sehr vorsichtig sein. Wie jemand einmal sagte, würden Enzymkinetiker lieber die Zahnbürsten des anderen benutzen als die Nomenklatur des anderen.

Da haben wir es also: Die beiden Fälle, die reversible Hemmung "abgrenzen", sind Fälle, in denen nur die scheinbare V _max geändert wird (nicht kompetitive Hemmung) und in denen nur die scheinbare V _max /K _m (die Spezifitätskonstante) geändert wird (kompetitive Hemmung). Bei einer „gemischten“ Hemmung werden die scheinbaren Werte dieser beiden kinetischen Konstanten beeinflusst, und ein Sonderfall der „gemischten“ Hemmung liegt vor, wenn die scheinbaren Werte beider kinetischen Konstanten im gleichen Maße verringert werden, was zu keiner Änderung der Michaelis führt Konstante.

2. Reversible Inhibitormechanismen

Bisher habe ich nichts über die Mechanismen gesagt, die zu diesen Hemmungsmustern führen könnten. Vorrunde:

• Im Folgenden$K_m$ist die Michaelis-Konstante,$V_{max}$ist die maximale Geschwindigkeit,$s$ist die Substratkonzentration,$i$die Inhibitorkonzentration ist, und$K_{i}$und$K_{ii}$sind Hemmungskonstanten. Beide$v$und$v_i$beziehen sich auf die Anfangsgeschwindigkeit.
• Hemmungsmuster werden unter Verwendung des Lineweaver-Burk- Plots analysiert. Dies ist praktisch, da in einem solchen Diagramm (siehe diesen Wikipedia-Artikel) der y-Achsenabschnitt gleich ist$1$/$V_{max}$und die Steigung gleich ist$K_m$/$V_{max}$. Änderungen des scheinbaren Werts von$V_{max}$manifestieren sich als y-Achsen-Abschnittseffekt und Änderungen der Spezifitätskonstante ($V_{max}$/$K_m$) manifestieren sich als Steigungseffekt. Außerdem ist der Schnittpunkt der x-Achse gleich$-1$/$K_m$, so dass sich das Scheinbare ändert$K_m$Wert oder das Fehlen einer solchen Änderung ist leicht zu erkennen.
• Das Lineweaver-Burk- Diagramm ist nicht die einzige lineare Transformation der Michelis-Menten-Gleichung, oder sogar die beste (siehe hier ). Andere Plots sind der Hanes-Woolf- Plot und der Eadie-Hofstee -Plot. Wie jemand anderes einmal sagte, beten Biochemiker am Altar der geraden Linie. Ich verwende das Lineweaver-Burk-Diagramm, weil es zumindest meiner Meinung nach am intuitivsten ist.
• Es muss berücksichtigt werden, dass viele kinetische Mechanismen zu einem Hemmungsmuster führen können. Viele kinetische Mechanismen können beispielsweise zu einer kompetitiven Hemmung führen. Was folgt, sind anschauliche Beispiele.
• Alle nachstehenden Diagramme (mit Mathematica erstellt ) wurden mit erstellt$V_{max}$= 100 und$K_m$= 10. Wenn nur eine Hemmkonstante erforderlich war ($K_i$), wurde es auf 100 gesetzt. Wenn zwei erforderlich waren, wurde das zweite ($K_{ii}$) wurde auf 20 gesetzt (Alle 'beliebigen Einheiten'). Die Diagramme sind natürlich sehr einfach zu erzeugen und können mit vielen Softwareanwendungen erstellt werden.

(a) Wettbewerbshemmung

Betrachten wir die reversible Hemmung in einem Einzelsubstrat-Enzym, die durch den oben gezeigten Mechanismus beschrieben wird, bei dem sowohl der Inhibitor als auch das Substrat um das "freie" Enzym konkurrieren.

Die Ableitung des Geschwindigkeitsgesetzes für diesen Mechanismus unter Verwendung entweder der Gleichgewichts- oder der Steady-State -Annahme führt zu einer Gleichung der folgenden Form (schöne Ableitungen finden sich in Segel , 1975):

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over{K_{m}(1 + {i\over{K_{i}}})} + s}\ \ \ \ \ (1)$$

Repräsentative Diagramme von Gleichung (1), die die Wirkung steigender Inhibitorkonzentrationen zeigen:

Das Bilden von Kehrwerten von Gleichung (1) gefolgt von einer Umordnung führt zur linearen Lineweaver-Burk-Transformation:

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}(1 + {i\over{K_i}})( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}\ \ \ \ \ (2)$$

Es ist sofort ersichtlich, dass der Inhibitor den scheinbaren Wert von erhöht$K_{m}$/$V_{max}$aber wirkt nicht 1 /$V_{max}$.

Das heißt, es beeinflusst die Spezifitätskonstante ($V_{max}$/$K_{m}$) aber nicht$V_{max}$. Die Hemmung ist daher kompetitiv

Diagramme von Gleichung (2) sagen eine Schar gerader Linien voraus, die sich auf der y-Achse bei schneiden$1$/$V_{max}$, und das kompetitive Hemmungsmuster ist leicht zu erkennen:

In Bezug auf die Lineweaver-Burk-Transformation bewirkt ein kompetitiver Inhibitor, dass die Steigung zunimmt, ändert aber nicht den Schnittpunkt der y-Achse .

Wir können auch noch einen Schritt weiter gehen. Die Steigungen der obigen Linien sind durch die folgende Gleichung gegeben:

$$slope = \frac{K_m}{V_{max}} + \frac{K_m}{V_{max} K_{i}}{i}\ \ \ \ \ (3)$$

Daher wird vorhergesagt, dass ein Diagramm der Steigung gegen die Inhibitorkonzentration eine gerade Linie ist, die die x-Achse bei – schneidet.$K_i$

Solche Replots erfüllen zwei Funktionen. Erstens ermöglichen sie die Bestimmung der$K_{i}$Wert. In diesem Fall beträgt der Schnittpunkt der x-Achse -100, was nicht allzu überraschend ist, da 100 der Wert von war$K_i$in der Simulation gewählt. Zweitens prüfen sie auf unerwartete kinetische Komplexität. Beispielsweise könnte ein Replot mit gekrümmter Steigung auf eine teilweise kompetitive Hemmung hinweisen, bei der der EI-Komplex möglicherweise zusammenbrechen kann, um ein Produkt zu ergeben. Eine solche kinetische Komplexität ist wahrscheinlich selten bei Einzelsubstratenzymen, kann aber bei Multisubstratenzymen auftreten (und kann die Ablehnung eines einfachen kinetischen Mechanismus als Erklärung für kinetische Daten erfordern). Segel (1975) geht sehr stark auf die partielle Hemmung und die Mechanismen ein, die sie hervorrufen können. Wenn der Steigungs-Replot linear ist, können wir von einer linearen kompetitiven Hemmung sprechen (siehe Cornish-Bowden, 2004).

Zur Wettbewerbshemmung kann eine Reihe von Punkten angeführt werden:

• Eines der „Markenzeichen“ der kompetitiven Hemmung ist, dass die hemmende Wirkung durch Zugabe von überschüssigem Substrat überwunden werden kann.
• Ein kompetitiver Inhibitor muss nicht an die aktive Stelle binden. Erforderlich ist lediglich, dass es sich so an das freie Enzym bindet, dass eine Substratbindung verhindert wird . Ein allosterischer Inhibitor kann beispielsweise kompetitiv sein. Aber natürlich ist die Konkurrenz zwischen dem Substrat und dem Inhibitor um dieselbe aktive Stelle ein Weg, auf dem eine kompetitive Hemmung entstehen kann (unter der Annahme, dass die Bindung des Inhibitors die Substratbindung verhindert). Segel (1975) ist in diesem Punkt sehr stark.
• Ein gutes Beispiel für einen kompetitiven Inhibitor ist Malonsäure, die Succinatdehydrogenase hemmt (siehe Segel, 1975). In der Welt der Zwei-Substrat-Kinetik ist Pyrazol ein kompetitiver Inhibitor der Pferdeleber-Alkohol-Dehydrogenase in Bezug auf Ethanol, und ein klassisches Papier (Li und Theorell), das dies zeigt, ist hier verfügbar

Lassen Sie uns abschließend diesen Punkt wiederholen: Gleichung (1) beschreibt einen Mechanismus, der zu einem kompetitiven Hemmungsmuster führt . Es ist sicherlich nicht das einzige.

(b) Nicht kompetitive Hemmung

Betrachten wir nun einen Mechanismus, der durch das obige Diagramm beschrieben wird, bei dem der Inhibitor nicht an das "freie" Enzym binden kann, sondern stattdessen an den Enzym-Substrat-Komplex bindet (um einen fehlgeschlagenen ternären EAI-Komplex zu ergeben).

Die Ableitung des Geschwindigkeitsgesetzes und seines Mechanismus (wiederum entweder unter Annahme des stationären Zustands oder des Gleichgewichts; siehe Segel, 1975) führt zu einer Gleichung der folgenden Form:

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over{K_{m}} + (1 + {i\over{K_{i}}}) s}\ \ \ \ \ (3)$$

Umwandlung in die Lineweaver-Burk -Form:

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}(1 + {i\over{K_i}})\ \ \ \ \ (4)$$

In diesem Fall erhöht der Inhibitor den scheinbaren Wert von 1 /$V_{max}$wirkt aber nicht$K_{m}$/$V_{max}$

Mit anderen Worten, es beeinflusst den scheinbaren Wert von$V_{max}$, hat aber keinen Einfluss auf die Spezifitätskonstante ($V_{max}$/$K_{m}$). Die Hemmung ist daher nicht kompetitiv .

Darüber hinaus hebt im Gegensatz zur kompetitiven Hemmung die Erhöhung der Substratkonzentration die Hemmung nicht auf.

Ein nicht kompetitiver Inhibitor bewirkt, dass die Steigung eines Lineweaver-Burk-Diagramms zunimmt, ändert jedoch nicht den y-Achsenabschnitt eines solchen Diagramms .

Daher doppelt-reziproke Plots von$1$/$v_i$ vs $1$/$s$Bei verschiedenen$i$bilden eine Schar paralleler Linien .

In diesem Fall ist die$K_{i}$kann aus einem Intercept-Replot bestimmt werden, wobei der X-Achsen-Intercept -$K_i$.

$$intercept={1\over{V_{max}}} +{i\over{V_{max} {K_i}}}\ \ \ \ \ (5)$$

(c) Gemischte Hemmung

Betrachten wir nun einen Mechanismus, bei dem der Inhibitor entweder an das „freie“ Enzym oder den Enzym-Substrat-Komplex binden kann und (um die Dinge einigermaßen realistisch zu halten), bei dem das Substrat entweder an das freie Enzym oder den Enzym-Inhibitor-Komplex binden kann.

Unter bestimmten vereinfachenden Annahmen (siehe Segel, 1975) kann der oben gezeigte Mechanismus zu folgendem Geschwindigkeitsgesetz führen:

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over{K_{m}(1 + {i\over{K_{i}}})} + (1 + {i\over{K_{ii}}}) s}\ \ \ \ \ (6)$$

In diesem Fall gibt es zwei Hemmungskonstanten, von denen eine die Bindung des Inhibitors an das „freie“ Enzym „regelt“ ($K_{i}$) und eine, die die Bindung des Inhibitors an den Enzym-Substrat-Komplex ($K{ii}$).

Wenn man Kehrwerte nimmt, kann die entsprechende Lineweaver-Burk-Transformation wie folgt ausgedrückt werden:

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}(1 + {i\over{K_i}})( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}(1 + {i\over{K_{ii}}})\ \ \ \ \ (7)$$

Der Inhibitor erhöht sowohl scheinbar den Wert von 1 /$V_{max}$und (nicht unbedingt derselbe Faktor) und der scheinbare Wert von$K_{m}$/$V_{max}$. Die Hemmung ist daher gemischt .

Gleichung (7) sagt eine Schar von geraden Linien voraus, die sich in einem einzigen Punkt schneiden:

$$({x, y})= (-\frac{K_{ii}}{K_i K_m}, \frac{K_{i} - K_{ii}}{K_i V_{max}}) = (-0.02,0.008) \ \ \ \ \ (8)$$

In diesem Fall können Neigungs- und Schnittpunkt-Wiederholungen verwendet werden, um die Werte von zu bestimmen$K_i$und$K_{ii}$. Eine detaillierte Analyse solcher Plots findet sich in Segel (1975).

(d) Nicht-kompetitive Hemmung

Wir kommen nun zum Fall der nicht-kompetitiven Hemmung, die (wie oben erwähnt) am besten als Sonderfall der gemischten Hemmung betrachtet werden kann. Wann$K_i$=$K_{ii}$, Gl. (6) vereinfacht sich zu:

$$v_{i} = { {{{V_{max}}}\ s\ }\over(1 + {i\over{K_{i}}})(K_{m} +s)}\ \ \ \ \ (9)$$

Die Lineweaver-Burk- Transformation:

$${1\over{v_i}}=\frac{K_m}{V_{max}}(1 + {i\over{K_i}})( {1\over{s}}) + {1\over{V_{max}}}(1 + {i\over{K_{i}}})\ \ \ \ \ (10)$$

Gleichung (10) sagt eine Familie von Linien voraus, wo sie ansteigt$i$beeinflusst sowohl die Steigung als auch den Achsenabschnitt in gleichem Maße, und die sich auf der x-Achse bei schneiden$-1$/$K_m$

Aber warum sollte$K_i$gleich$K_{ii}$in jedem realistischen Fall?

Anmerkungen

Fersht besitzt nun das Urheberrecht an seinem Buch und verteilt es kostenlos

Alle Ausgaben von Acta Chem Scand (1947–1999), einschließlich vieler klassischer Papiere, sind online verfügbar

Ein Beispiel für die Ableitung eines Steady-State-Ratengesetzes finden Sie in dieser Biology Stack Exchange-Antwort

Verweise

Cook, PF & Cleland , WW (2007). Enzymkinetik und Mechanismus. Garland Science Publishing (Taylor & Francis Group). London & NewYork.

Cornish-Bowden , A. (2004). Grundlagen der Enzymkinetik. 3. Aufl. Portland Press Ltd., London.

Dalziel, K. (1957). Steady-State-Anfangsgeschwindigkeiten bei der Bewertung von Enzym-Coenzym-Substrat-Reaktionsmechanismen. Acta Chem. Scannen. 11, 1706 - 1723. [ pdf ]

Dalziel, K. (1975). Kinetik und Mechanismus von Nicotinamid-Nukleotid-verknüpften Dehydrogenasen. In The Enzymes, 3. Aufl., Bd. 11. Boyer, PD, Ed. S. 1–60. Academic Press, New York.

Fernt, A. (1999). Struktur und Mechanismus in der Proteinwissenschaft. Ein Leitfaden zur Enzymkatalyse und Proteinfaltung. W. H. Freeman, New York. [ pdf ]

Li, T. - K. & Theorell, H. (1969). Alkoholdehydrogenase aus der menschlichen Leber: Hemmung durch Pyrazol und Pyrazol-Analoga. Acta Chem. Scannen. 23, 892 - 902. [ pdf ]

Lineweaver, H. & Burk, D. . (1934). Die Bestimmung von Enzymdissoziationskonstanten. Marmelade. Chem. Soc . 56, 658 - 666.

Segel , IH (1975). Enzymkinetik. Verhalten und Analyse von schnellen Gleichgewichts- und Steady-State-Enzymsystemen. John Wiley & Sons, Inc., New York.

Kompetitiver Inhibitor konkurriert um das aktive Zentrum. Daher stört es die Bindung des Substrats, wodurch die scheinbare K _M erhöht wird .

Ein strikt nicht-kompetitiver Inhibitor konkurriert nicht um das aktive Zentrum. Es hemmt jedoch die Katalyse, indem es die verfügbaren Moleküle des aktiven Enzyms E ₀ reduziert (wenn es ein perfekter Inhibitor ist), wodurch V _max gesenkt wird .

Es kann auch gemischte Hemmstoffe geben und es kann verschiedene Arten von gemischten Hemmungen geben. Zum Beispiel ein Inhibitor, der in die Katalyse eingreift und auch um das aktive Zentrum konkurrieren kann.

Je nachdem, wie Sie K _M definieren , kann ein nicht-kompetitiver Inhibitor es ändern oder nicht. Wenn ein solcher Inhibitor an das Enzym an der nicht-aktiven Stelle binden und seine k _cat reduzieren kann , ändert er im Falle der Briggs-Haldane-Kinetik sowohl die _KM als auch die V _max .