Eine Frage zur Immunpräzipitation zur Identifizierung interagierender Proteine?
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Unter Verwendung von rekombinantem Flag-markiertem Dcr-2 und His-markiertem Protein X wurden Pulldown-Assays durchgeführt, um zu bestimmen, ob Protein X und Dcr-2 direkt interagieren. Die rekombinanten Proteine (entweder allein oder in Kombination) in Bindungspuffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM Tris pH 7,5, 1 % Triton X-100) wurden durch an Sepharose-Kügelchen gekoppelte Flag-Antikörper heruntergezogen. Nach ausgiebigem Waschen wurden die Proteine mit SDS-Puffer von den Kügelchen eluiert, und doppelte Probensätze wurden durch SDS-PAGE analysiert. Von den Proteinen wurden auch Proben genommen, bevor sie im Pulldown-Assay verwendet wurden, und diese wurden auf demselben Gel laufen gelassen (Eingabespuren in Abbildung 2B). Ein Gel wurde mit Coomassie-Blau-Farbstoff gefärbt (Abbildung 2A), und das andere wurde für Western Blotting auf Nitrocellulose übertragen. Die Membran wurde mit einem His-Antikörper sondiert (Abbildung 2B).
Die Frage lautet: Interagieren Dcr‐2 und Protein X direkt?
Meine Argumentation ist, dass sie direkt interagieren. In Abb. 2B: Die intensiven Banden auf LHS zeigen, dass Dcr-2 mit Protein X interagiert, das an Anti-His gebunden ist. In Fig. 2A: das Protein X interagiert mit dem an den Antikörper FLAG gebundenen Dcr-2. Ich habe das Gefühl, dass ich das nicht sehr erkläre ... Könnte jemand bitte ihre Argumentation erklären? Danke
Antworten (1)
Chris
Erstens: Sie haben Recht mit Ihrer Argumentation, dass Protein X (X) und Dcr-2 direkt interagieren. Lassen Sie uns die Blots durchgehen: In der Eingabe überprüfen Sie die in die Einstellung geladenen Proteine und färben unspezifisch mit Coomassie. Dieser Teil des Blots zeigt Ihnen keinen unspezifischen Input, und beide interessierenden Proteine sind vorhanden. Dies zeigt auch, dass Dcr-2 viel größer als X ist, was eine einfache Identifizierung von Bandmustern ermöglicht.
Im Eluat sehen Sie nur Proteine, die direkt in der Reaktion gebunden werden oder die mit gebundenen Proteinen interagieren. Dcr-2 ist mit einem Flag-Tag versehen, sodass es direkt an die Kügelchen bindet und von ihnen eluiert werden kann. Dies wird im Coomassie-Teil des Blots gezeigt. Dcr-2 allein bindet und kann eluiert werden, während X allein nicht bindet und daher kein Signal gibt. Dcr-2 und X ergeben zusammen zwei Banden, da Dcr-2 an die Beads bindet und X mit Dcr-2 interagiert.
Diese Bindung zeigt sich auch beim Anti-His-Antikörper, der nur Protein X erkennt. Das Protein taucht in der Eingabe auf, wo X hinzugefügt wird. Es zeigt sich auch in der Elutionsspur (wo auch Dcr-2 vorhanden ist), was zeigt, dass X ein Interaktionspartner für Dcr-2 ist.
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