Hat Harnstoff in unterschiedlichen Konzentrationen (5 oder 0,5 M) unterschiedliche Auswirkungen auf Proteine?

Das Problem besteht darin, zu erklären, warum jeder Zusatzstoff zu der Verteilung des Proteins (RMAS) führt, wie im folgenden westlichen Schlag gezeigt:

Geben Sie hier die Bildbeschreibung ein

In jedem Fall wurden die Homogenate einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation unterzogen und die Überstands-/Pelletfraktionen wurden getrennt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Gele wurden geblottet und mit einem gegen RMAS erzeugten Antikörper sondiert.

Ich stecke speziell fest, um die Wirkung von 0,5 M Harnstoff gegenüber 5 M Harnstoff auf die löslichen und unlöslichen Proteine ​​zu erklären, die durch das Pellet bzw. den Überstand repräsentiert werden. Mein Gedanke ist, dass bei niedrigen Harnstoffkonzentrationen (0,5 M) das Pelletprotein durch Harnstoff destabilisiert wird und die Löslichkeit zunimmt und eine Bande zeigt. Lösliche Proteine ​​sind jedoch denaturiert und zeigen keine Bande. Bei 5 M Harnstoff sind die Pelletproteine ​​jedoch reversibel löslich und zeigen sich daher nicht als Bande, wohingegen die löslichen Proteine ​​in Ordnung sind und daher eine "normale" Bande zeigen. Ich weiß nicht, ob das die richtige Erklärung ist, also könnte es mir bitte jemand erklären?

Antworten (1)

Was Sie tun müssen, ist die relativen Mengen des Proteins in der unlöslichen (Pellet-) Fraktion mit der löslichen (Überstand) zu vergleichen. So können Sie feststellen, wie löslich das RMAS durch die Wirkung der angegebenen Verbindung geworden ist.

DTT bricht Disulfidbindungen auf, tut aber sonst nichts, um das Protein zu lösen, also ist alles im Pellet, und nichts ist im Supe nachweisbar. NaCl ist ein Salz, das die ionische "Stärke" des Lysepuffers erhöht, aber nicht wirklich etwas dazu beiträgt, das Protein zu lösen, sodass wieder das gesamte Ziel im Pellet verbleibt. Andererseits befreien Detergenzien wie Triton und SDS das Protein von der unlöslichen Fraktion und bewegen das meiste davon in den Überstand, was zu dem Muster führt, das Sie für sie sehen. Abhängig von der genauen subzellulären Lokalisierung des interessierenden Proteins und der Menge und Kombination der verwendeten Detergenzien sehen Sie im Pellet möglicherweise überhaupt kein Protein, da alles solubilisiert wurde.

Harnstoff und Guanidiniumhydrochlorid sind chaotrope Mittel , die Wasserstoffbindungen, Van-der-Waals-Kräfte stören und hydrophobe Assoziationen schwächen, was bewirkt, dass das Protein denaturiert und sich von anderen Proteinen im Pellet trennt, wodurch es in die Supere gebracht wird. Dieser Effekt wird im Allgemeinen bei relativ hohen Molaritäten beobachtet (z. B. wird häufig GuHCl im Bereich von 6–8 M verwendet), was den Unterschied in der Wirkung erklärt, der bei 0,5 und 5 M Harnstoff beobachtet wird. Bei niedrigen Konzentrationen ist einfach nicht genug Harnstoff vorhanden, um das Protein effektiv zu denaturieren. Ich bin ein wenig überrascht, dass auf der 0,5-Meter-Spur nichts auftauchte, aber dies ist nur ein simulierter Western, der ideale Ergebnisse zeigt - im wirklichen Leben sind die Dinge fast nie so durchgeknallt.

Hat Harnstoff in unterschiedlichen Konzentrationen (5 oder 0,5 M) unterschiedliche Auswirkungen auf Proteine?
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v