Niedrige Kopienzahlen von Plasmiden

Ich habe ein Plasmid mit dem P15A-Ursprung, das anscheinend eine niedrige Kopienzahl hat (siehe hier ). Dies würde erklären, warum meine Reinigungsausbeuten für den anschließenden Verdau gering sind (das Gel zeigt das Plasmid nach dem Verdau und der Reinigung mit 5 &mgr;l Beladung). Ich züchte derzeit mein E. coli-haltiges Plasmid in 5 ml über Nacht, bevor ich eine Miniprep durchführe. Meine Frage ist, sollte ich meine 5ml-Kulturen länger wachsen lassen (2 Tage) oder einfach aufgeben und eine größere Menge für Midiprep machen.

    Plasmid-Gel

Ich bin auch neugierig, was tatsächlich die Plasmidkopienzahl in Zellen steuert. Eine Erläuterung der Regulation der Plasmidkopienzahl wäre sehr willkommen.

Wie lautet der grundlegende Name des Plasmids? Wie viel Plasmid haben Sie tatsächlich für den Verdau verwendet? Was sind Ihre Erträge aus einem Miniprep?
@Chris Es heißt pACYCHO, also vermute ich, dass es ein Derivat des pACYC-Plasmids ist. Oh und danke WYSIWYG, ich wusste nicht, dass man so Links macht.

Antworten (1)

  • Ich bin sicher, Sie haben es getan; Nur eine Anmerkung für andere: Führen Sie einen PCR-Screen durch, um sicherzustellen, dass das Plasmid vorhanden ist.
  • Für Minipreps benötigen Sie im Allgemeinen keine Starterkultur.
  • Wenn Sie Ihre Klone gescreent haben und das Plasmid nun nur noch für Klonierungszwecke amplifizieren und behalten möchten, entscheiden Sie sich für eine Maxiprep mit 200-400 ml Kulturen.
  • Überwachsen Sie die Zellen nicht, Ihre Extraktion wird schwierig und Sie würden noch schlechtere Erträge erzielen. Richten Sie einfach eine riesige Kultur ein und bündeln Sie die Zellen vor der Extraktion. Säen und ernten Sie immer Zellen, die sich in der exponentiellen Wachstumsphase befinden.
  • Wenn Sie das Plasmid nach Klonen oder etwas anderem durchsuchen müssen, führen Sie eine Kolonie-PCR durch, halten Sie die Kolonie in einer kleinen Kultur inokuliert (stellen Sie einen temporären Glycerinvorrat her, wenn Ihr Screening einige Zeit in Anspruch nimmt). Wenn der Screen positiv ist, inkubieren Sie die Starterkultur für die Maxiprep/Gigaprep-Kultur mit dieser Stammkultur.
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