Phagemid-Display

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Ein Helfer-Phage zur Verbesserung der Einzelketten-Antikörper-Präsentation im Phagen-Display

Versuchsprotokoll

Standard-Klonierungsverfahren, Bestimmung von koloniebildenden Einheiten und Plaque-bildenden Einheiten und Immunoblot nach PAGE wurden gemäß Sambrook et al.

Aufbau der Verpackungszelllinie.

DH5alpha/pIII [M13KO7DeltapIII]. Das mit dem Promotor P/A1/04/03 (Ref. 17) fusionierte M13-pIII-Gen wurde in die multiple Klonierungsstelle des LambdaattP-Plasmids pLDR9 (Ref. 18) inseriert. Der Replikationsursprung und das Kanamycin-Resistenzgen wurden ausgeschnitten und die verbleibende nicht-replikative LambdaattP-pIII-DNA religiert. Das Plasmid pLDR8 (Ref. 18) enthaltendes Escherichia coli DH5alpha wurde mit der nicht-replikativen LambdaattP-pIII-DNA transformiert und auf Agarplatten ausplattiert, die 25 &mgr;g/ml Ampicillin enthielten. Nach Inkubation über Nacht bei 42°C wurden die erhaltenen Kolonien replikativ ausplattiert und Ampicillin-resistente Klone identifiziert, die als E. coli DH5alpha/pIII bezeichnet wurden. Anschließend wurden sie mit M13KO7DeltapIII transformiert, wodurch die Verpackungszelllinie E. coli DH5alpha/pIII [M13KO7DeltapIII] entstand.

Produktion von Phagen.

Um M13KO7DeltapIII-Helferphagen zu erhalten, wurde M13KO7DeltapIII-DNA in E. coli K802, enthaltend pNDI (Ref. 15), elektrotransfiziert. Um Hyperphagen zu erhalten, wurde M13KO7DeltapIII-DNA in E. coli DH5alpha/pIII elektrotransfiziert. Phagen wurden durch Kultivierung in Gegenwart von 0,5 mM Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG) bei 30°C für 24 h unter Schütteln bei 200 U/min Escherichia coli Top10F' oder E. coli Xl1blue, die das pSEXphOx(Yol)-Phagemid oder tragen, hergestellt eine scFv-Bibliothek in pSEX81 wurden mit einer Helfer-Phagen-Präparation bei einer OD600 von 0,1 bei einer Infektionsmultiplizität von 20 wie beschrieben infiziert.

Phagenquantifizierung durch ELISA.

Verdünnungsreihen von Phagen wurden in 100 mM NaHCO 3 , pH 8,6, in MaxiSorb ELISA-Platten (Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland) für 16 h bei 4°C beschichtet. Die Blockierung erfolgte mit 2 % Magermilchpulver in PBS (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7,3) für 2 h bei Raumtemperatur. Phagen wurden mit dem monoklonalen Maus-Antikörper B62-FE2 (Progen, Heidelberg, Deutschland) nachgewiesen, der spezifisch ein Epitop auf dem pVIII-Haupthüllprotein des M13-Phagen bindet. Zur Standardisierung wurden M13KO7-Phagen bekannter koloniebildender Einheiten verwendet.

Immunoblot.

Ungefähr 1010 Phagen wurden pro Bahn auf ein 10 % Polyacrylamidgel aufgebracht. Die Blockierung erfolgte mit 2 % Magermilchpulver in PBS für 2 h bei Raumtemperatur. Die Immunfärbung erfolgte mit dem Maus-mAb Anti-g3p (MoBiTec, Göttingen, Deutschland), der das pIII-Hüllprotein von M13KO7 erkennt, sichtbar gemacht mit 3,3', 5,5'-Tetramethylbenziden (TMB)-Substrat (Promega, Madison, WI).

Antigen-bindender Phagen-ELISA.

Verdünnungsreihen von BSA-phOx-Antigen in 100 mM NaHCO 3 , pH 8,6, wurden in MaxiSorb-ELISA-Platten (Life Technologies) für 16 h bei 4°C aufgetragen. Nach dem Blockieren der unspezifischen Bindung mit 2 % Magermilchpulver in PBS für 2 h bei Raumtemperatur wurden 2 mal 109 einkettige Phagen verdünnt in 2 % Magermilchpulver in PBS für 1 h bei Raumtemperatur in jede Vertiefung gegeben. Nach sechsmaligem Waschen mit 400 &mgr;l PBS pro Vertiefung wurden die gebundenen Phagen mit mAb B62-FE2 wie oben beschrieben nachgewiesen.

Schwenken.

Eine menschliche scFv-Fragmentbibliothek in pSEX81 mit einer berechneten maximalen Komplexität von 2 mal 107 wurde aus Präparationen peripherer Lymphozyten wie beschrieben erzeugt21. Sechs ELISA-Vertiefungen (Life Technologies) wurden mit Tetanustoxin, erhalten von Virotech (Rüsselsheim, Deutschland) in einer Konzentration von 0,1 ml/ml in 100 mM NaHCO 3 , pH 8,6, für 16 h bei 4°C beschichtet. Die Vertiefungen wurden mit 2 % Magermilch in PBS für 2 h bei Raumtemperatur blockiert, wonach 1011 Phagen der Bibliothek auf jede Vertiefung aufgetragen und über Nacht bei 4°C inkubiert wurden. Nach fünf Waschgängen mit PBS/0,1 % Tween und fünf Waschgängen mit PBS wurden gebundene Phagen mit 1 µg/ml Trypsin (Life Technologies) in PBS für 15 min bei Raumtemperatur eluiert. Eluierte Phagen wurden für die Infektion von 20 ml E. coli XL1blue bei einer OD600 von 0,4 verwendet.