Umkehrung der Quervernetzung in ChIP-seq

Die Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine Art von experimenteller Immunpräzipitationstechnik, die verwendet wird, um die Wechselwirkung zwischen Proteinen und DNA in der Zelle zu untersuchen. Eine Zusammenfassung des Protokolls für ChIP finden Sie hier . Kurz gesagt, die Schritte sind:

  1. DNA und assoziierte Proteine ​​auf Chromatin in lebenden Zellen oder Geweben sind vernetzt;
  2. Die DNA-Protein-Komplexe werden durch Beschallung oder Nukleaseverdau in ca. 500 bp DNA-Fragmente zerlegt;
  3. Vernetzte DNA-Fragmente, die mit dem/den interessierenden Protein(en) assoziiert sind, werden selektiv aus den Zelltrümmern unter Verwendung eines geeigneten proteinspezifischen Antikörpers immunpräzipitiert;
  4. Die zugehörigen DNA-Fragmente werden gereinigt und ihre Sequenz bestimmt.

Nach Schritt 3 (Immunpräzipitation des Protein-DNA-Komplexes) wird meines Wissens nach die Protein-DNA-Vernetzung umgekehrt und Proteine ​​werden durch Verdauung mit Proteinase K entfernt.

Kann mir jemand sagen, ob während dieses Schritts die DNA an der Stelle der Quervernetzung in den weiteren Sequenzierungsschritt einbezogen oder mit dem Protein selbst weggespült wird?

Willkommen bei Biology.SE! Ich habe die Frage ein wenig aufgeräumt - hoffe, die Änderungen sind in Ordnung.
Sie möchten also wissen, ob im Crosslink-Reversal-Schritt die DNA verloren geht?
Ja. Genauer gesagt an der Stelle, an der Protein und DNA befestigt sind.

Antworten (1)

Nach dem Crosslink-Umkehrschritt haben Sie immer noch etwas DNA, das mit Proteinfragmenten verbunden ist.

In diesem Schritt müssen wir also anstelle einer normalen DNA-Reinigung auch eine Phenol-Chloroform-Extraktion oder spezielle Säulen verwenden, um DNA von Proteinfragmenten zu trennen.

Thermofisher gibt normalerweise auch wirklich gute Erklärungen .

Bitte lassen Sie mich wissen, wenn ich die Frage nicht richtig verstanden habe! :)

Umkehrung der Quervernetzung in ChIP-seq
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