Unterschied zwischen LIGR-seq- und PARIS-Methoden

LIGR-seq

LIGR-seq (Abbildung 1A) nutzt die In-vivo-Vernetzung von RNA-Doppelsträngen unter Verwendung des modifizierten Psoralen-Derivats 4'-Aminomethyltrioxalen (AMT), das in RNA-Doppelstränge interkaliert und bei 365-nm-UV-Bestrahlung Interstrang-Addukte zwischen nebeneinander angeordneten Pyrimidinbasen erzeugt ( Calvet und Pederson, 1979). Nach der Zelllyse und einem begrenzten Einzelstrang-S1-Endonuclease-Verdau werden freie RNA-Überhänge neben Duplexen unter Verwendung von circRNA-Ligase ligiert. Diese Ligase katalysiert die ATP-abhängige Ligation proximaler RNA-Enden und hat eine optimale Aktivität bei erhöhten Temperaturen, die die RNA-Hybridisierung reduzieren. RNase R, eine 3′→5′-Exoribonuclease, die lineare und strukturierte RNAs verdaut (Vincent und Deutscher, 2006), wird dann verwendet, um unvernetzte RNA zu verdauen, wodurch AMT-vernetzte Duplexe angereichert werden (Abbildungen 1A und S1). Nach der Aufhebung der Vernetzungen unter Verwendung von 254-nm-Bestrahlung werden die RNA-Proben einer Hochdurchsatz-Sequenzierung unterzogen, um durch Ligation gebildete Chimären nachzuweisen. Zur Bewertung von Ligationsartefakten im Hintergrund werden nicht quervernetzte („–AMT“) Proben parallel präpariert, und nicht ligierte Proben werden verwendet, um die relative Expression von Transkripten zu bestimmen, die Chimären für die nachgelagerte Normalisierung und Analyse bilden.

Zusammengefasst

AMT-Crosslinking ⟶ Zelllyse ⟶ S1-Endonuklease-Verdau ⟶ RNA-RNA-Ligation mit circRNA-Ligase ⟶ RNase R-Verdau von unvernetzter RNA ⟶ Crosslink-Umkehrung ⟶ Sequenzierung Bibliotheksvorbereitung (Adapter-Ligation, reverse Transkription usw . )

---

PARIS

HeLa-, HEK293T- und mES-Zellen wurden mit oder ohne AMT behandelt und mit 365 nm UV vernetzt. Zelllysate wurden mit S1-Nuclease verdaut und RNA unter Verwendung von TRIzol gereinigt. Gereinigte RNA wurde weiter mit ShortCut RNase III zu kleineren Fragmenten verdaut. RNA wurde durch 12 % natives Polyacrylamidgel aufgetrennt, und dann wurden die Gelscheiben der ersten Dimension in einem 20 % Harnstoff-denaturierten Gel der zweiten Dimension weiter einer Elektrophorese unterzogen. Quervernetzte RNA oberhalb der Hauptdiagonalen wurde eluiert, mit T4-RNA-Ligase I in der Nähe ligiert und mit 254 nm UV photoumgekehrt. Die Proximity-ligierten RNA-Moleküle wurden dann an Barcode-Adapter ligiert und in Bibliotheken für die Illumina-Sequenzierung umgewandelt.

Zusammengefasst

AMT-Crosslinking ⟶ Zelllyse ⟶ S1-Endonuklease-Verdau ⟶ TRIzol-Reinigung ⟶ ShortCut RNase III-Verdau ⟶ 2D-Gel-Reinigung ⟶ RNA-RNA-Ligation mit T4 RNA-Ligase 1 ⟶ Crosslink-Reversal ⟶ Sequenzierung Bibliotheksvorbereitung (Adapter-Ligation, reverse Transkription etc . )

---

Bezüglich der Erfassung von RNA-RNA-Wechselwirkungen sind diese Methoden im Wesentlichen gleich. Angesichts der Tatsache, dass beide Artikel in derselben Woche in den Zeitschriften von Cell Press veröffentlicht wurden, wurden sie wahrscheinlich gleichzeitig in konkurrierenden Labors entwickelt. Es kann sein, dass die Herausgeber die Veröffentlichung so koordiniert haben, dass keine der beiden Gruppen das Gefühl hat, „abgeschöpft“ worden zu sein.

Soweit ich das beurteilen kann, besteht der Hauptunterschied darin, wie die Methoden In-vivo- RNA-Interaktoren von vorübergehenden RNA-RNA-Hybridisierungsereignissen unterscheiden, die im Verlauf der Protokolle auftreten. In LIGR-seq enthalten sie eine unvernetzte („–AMT“)-Kontrolle, sodass sie echte Wechselwirkungen vom Hintergrundrauschen unterscheiden können, indem sie nach Ligationschimären suchen, die in den +AMT-Proben relativ zu –AMT angereichert sind. In PARIS besteht die zweite Dimension des 2D-Gels aus 20 % Harnstoff, der dazu dienen würde, alle nicht vernetzten dsRNA-Moleküle vor der Ligation zu denaturieren; Weitere Informationen finden Sie in den vollständigen Methoden :

Gelscheiben jeder Spur wurden eingebettet und in die Oberseite des 20% Harnstoff-TBE-denaturierten Polyacrylamidgels der zweiten Dimension polymerisiert ... Das Gel der zweiten Dimension hat aufgrund der hohen Leistung eine höhere Temperatur, und die hohe Temperatur erleichtert die Denaturierung der dsRNA-Fragmente .

Es kann auch einen Unterschied in der Längenverteilung der am Ende jedes Verfahrens erhaltenen chimären RNA-Moleküle geben, da LIGR-seq und PARIS unterschiedliche RNase-Enzyme mit unterschiedlichen Verdauungsparametern verwenden.