Was sind die Vor- und Nachteile der ortsgerichteten Mutagenese? Was sind die Alternativen?

Für ein Praktikum wurden wir beauftragt, „ein Stoppcodon, das sich in der Mitte eines Gens befindet, durch Mutagenese zu entfernen, damit das gesamte Gen exprimiert wird. Dieses wird dann fluoreszieren.“

Dazu erwägen wir die ortsgerichtete Mutagenese, die das Stoppcodon ersetzen kann, aber ist dies eine gute Methode? Gibt es Alternativen zu SDM mit Quikchange, die besser sind? Was sind die Vor- und Nachteile des SDM, das wir durchführen möchten? Um zu sehen, ob uns das gelungen ist, werden wir dann DNA-Sequenzierung und Gelelektrophorese verwenden.

Unser Gesamtplan sieht so aus:

  1. Sammeln von Plasmiden aus E. coli

  2. Gelelektrophorese der Plasmid-DNA

  3. Führen Sie die Mutagenese mit Quikchange durch
  4. Transformation durch Hitzeschock
  5. PCR
  6. Verwenden Sie einen lac-Promotor, um das Genprotein herzustellen

Ein Problem, das mir einfiel, war, wie stellen wir sicher, dass die Primer, die die Mutation tragen, aufgrund ihrer Komplementarität nicht aneinander anlagern?

Ist Overlap-Extension eine gute Alternative? Gibt es Vorteile bei der Verwendung von transposonbasierter oder punktgerichteter Mutagenese?

Vielen Dank!

Wenn es mein Labor wäre, würden wir einfach ein synthetisches Gen bestellen …
Hängt davon ab ... geht es um den Prozess oder das Ergebnis?

Antworten (2)

SDM ist das perfekte Werkzeug für diese Mission, es sei denn, das betreffende Plasmid ist sehr groß (20+ kb).

Wenn Sie die SDM durchgeführt haben, verdauen Sie die Produkte mit dpnI, um die ursprünglichen Plasmide zu entfernen, transformieren Sie e.coli und verwenden Sie ein selektives Medium, das zu Ihrem Plasmid passt. Nur Bakterien mit dem Plasmid können dann überleben und Kolonien bilden, mehrere Kolonien auswählen und für jede eine Miniprep durchführen und den interessierenden Bereich sequenzieren. Sie können den Rest des Miniprep mit dem richtigen Plasmid für die Transformation und Expression verwenden. Überspringen Sie also Schritt 5.

Obwohl, wie Sie sagen, SDM das am besten geeignete Werkzeug ist, sind die anderen Formen der Mutagenese: Transposon-basiert und punktgerichtet auch für dieses Labor anwendbar, wenn wir wollten? Und können Sie sich irgendwelche Nachteile bei der Verwendung von SDM in diesem Fall vorstellen?

Die 'Quickchange'-Methode ist wahrscheinlich das, was Sie wollen. Wenn Sie sich Sorgen über Selbstkomplementarität machen (was nicht zu viel sein sollte), können Sie die Primer tatsächlich so versetzen, dass sie nicht vollständig komplementär sind. nur die 10 bp müssen dort überlappen, wo sich die Mutation befindet. Ich habe unten ein kleines Diagramm eingefügt, in dem das X die Basis markiert, die Sie ändern möchten

Überlappende Primer

Eine Alternative, die ich häufiger verwende als das SDM, ist die Verwendung von TypeIIS-Restriktionsenzymen. Auf diese Weise können Sie beliebig viele Basen auf einmal mutieren! Siehe diesen Artikel

Was sind die Vor- und Nachteile der ortsgerichteten Mutagenese? Was sind die Alternativen?
AntwortenHierDatenschutz-Bestimmungen1y, 0v