Ich arbeite mit den Plasmiden pETDuet und pRSFDuet, um RNAs unter der Kontrolle des T7-Promotors zu exprimieren. Auf diesen Plasmiden befinden sich die Antibiotikaresistenzgene (Amp für pET und Kan für pRSF) stromabwärts der T7-Promotorstelle, wo ich meine Gene kloniert habe. Die Amp- und Kan-Gene werden in der entgegengesetzten Orientierung des T7-Promotors transkribiert, und da diese Gene stromabwärts von der Stelle liegen, an der ich meine Gene eingefügt habe, würde die Readthrough-Transkription von den Resistenzgenen zu einer Sequenz führen, die komplementär zu der RNA-Sequenz ist, die ich produzieren möchte. Meine Frage ist: Haben die Antibiotikaresistenzgene in diesen Plasmiden einen eingebauten Transkriptionsterminationsmechanismus?
Ich habe das ARNold-Tool verwendet: http://rssf.i2bc.paris-saclay.fr/toolbox/arnold/index.php , um nach Rho-unabhängigen Terminatoren am 3'-Ende der Antibiotikaresistenzgene und in der Region stromabwärts zu suchen . Es gab einen Treffer für das pETDuet-Plasmid, aber nichts für das pRSFDuet-Plasmid. Auch für die Plasmide pCDFDuet oder pCOLADuet gab es keine Treffer. Mein Gefühl ist, dass Haarnadelterminatoren nicht speziell eingebaut wurden, um die Transkription stromabwärts der Antibiotikaresistenzgene zu stoppen. Die andere Möglichkeit ist, dass die Antibiotikaresistenzgene auf Rho-abhängige Weise enden, ist dies für die Amp- und Kan-Gene bekannt?
Im Allgemeinen tun sie dies, aber dies stoppt den Transkriptionsdurchlauf oft nicht vollständig.
Beachten Sie, dass bei einer T-7-Reaktion keine Transkription der Amp- oder Kan-Gene stattfinden sollte, da dies Run-Off-Promotoren sind, die die T7-Phagen -RNA-Polymerase nicht abschreiben kann, da sie extrem spezifisch für den T7-Promotor ist .
Die Lösung, wenn Sie wirklich besorgt sind, besteht darin, Ihr Plasmid unmittelbar nach Ihrem Terminator, aber vor dem AMPR-Gen mit einem Restriktionsenzym mit einem einzigen Schnitt zu linearisieren. Dadurch erhalten Sie auch eine Sequenz mit einer bestimmten Größe, die transkribiert wird, was sehr nützlich ist, wenn Sie die Kopienzahl beispielsweise in einer qPCR bestimmen.