Quantifizierung der Genexpression

Was ist das Proteinexpressionsniveau?

Dies war der ursprüngliche Titel des Beitrags, den ich selbst bearbeitet habe, weil ich die Antwort für trivial, die Frage aber für wesentlicher halte. Um das Triviale zuerst zu behandeln:

„Pegel“ ist keine wissenschaftliche Einheit und kann nur in Bezug auf Flüssigkeiten eindeutig als wissenschaftlicher Begriff im englischen Sinne verwendet werden, zB „Der Quecksilberpegel im Thermometer war gesunken“, „Das Land liegt 10 Meter über dem Meeresspiegel eben."

Es wird von einigen Personen in informellen Reden oder Schriften verwendet, um auf eine undefinierte Quantifizierung hinzuweisen, und aufgrund seiner Mehrdeutigkeit ist in der wissenschaftlichen Kommunikation dringend davon abzuraten.

Weder ich noch sonst jemand kann also sagen, was „Proteinexpressionsniveau“ ist, ohne herauszufinden, was der Urheber des Ausdrucks in jedem einzelnen Fall beabsichtigt hat (falls er es tatsächlich wusste): Menge oder Konzentration von Protein oder die Geschwindigkeit seiner Synthese.

Quantifizierung

Lassen Sie uns einige allgemeine Aspekte eines zellulären Moleküls betrachten, die eine Quantifizierung erfordern können : Menge, Syntheserate, Abbaurate und, wo relevant, biologische Aktivität.

Die Quantifizierung von Molekülen ist im Grunde genommen die Anzahl der Arten oder, praktischer, ihre Gesamtmasse (Gramm), wenn möglich im Verhältnis zu ihrer Molekülmasse (dh Mol). Die Rate ihrer Synthese oder ihres Abbaus wird als Änderung ihrer Menge in Zeiteinheiten ausgedrückt.

Um verschiedene Systeme vergleichen zu können, wird eine Referenz für die Quantifizierung benötigt. Dies kann pro Volumeneinheit, pro Zelle, pro g zellulärem Protein, pro g DNA usw. sein. (Zum Vergleich ähnlicher Systeme oder innerhalb eines Systems wird die Referenz jedoch oft weggelassen.)

Die biologische Aktivität von Molekülen hat nur dann eine Bedeutung, wenn die Moleküle tatsächlich biologisch aktiv sind (z. B. Enzyme). Sie wird in Einheiten ausgedrückt, die sich auf diese Aktivität beziehen.

Beispiele für die Quantifizierung von Proteinen

Die tatsächlich bei der Quantifizierung verwendeten Einheiten werden dadurch bestimmt, wie man den interessierenden Parameter messen kann.

Relative Proteinmenge: Sie können ein Protein anhand der Intensität der Färbung einer Bande auf einem Gel oder anhand des Ausmaßes der Präzipitation mit einem entsprechenden Antikörper erkennen. Diese müssten gegen Standards kalibriert werden, um rohe experimentelle Messungen in g oder Mol Protein umzuwandeln. Typische Einheiten relativer Mengen sind g/g Gesamtprotein, g/g DNA.

Rate der Synthese oder des Abbaus von Protein. Sie können die Proteinsynthese anhand der Einbaurate radioaktiver Aminosäuren in nicht radioaktives Protein und die Abbaurate anhand der Freisetzung radioaktiver Aminosäuren aus vormarkiertem Protein nachweisen. Typische Syntheseeinheiten wären mg Aminosäure, die pro Minute pro mg Gesamtprotein eingebaut wird. (Dies kann bei Bedarf in pro Minute synthetisierte oder abgebaute Moleküle umgewandelt werden.)

„Proteinaktivität“ : Die Verwendung dieses Begriffs wird nicht empfohlen. Chemisch gesehen ist die Aktivität eines Moleküls ein Maß für seine „effektive Konzentration“ und würde in Bezug auf Proteine ​​nur Biophysiker und dergleichen interessieren. Andere Biologen würden den Begriff mit der biologischen Aktivität assoziieren, die ein Protein wie ein Enzym haben könnte, aber da viele Proteine ​​strukturell sind, kann der Begriff „Aktivität“ nicht allgemein auf Proteine ​​angewendet werden. Wo es von Interesse ist, würde es hinsichtlich der Art der Aktivität quantifiziert werden, z. B. wird ein Enzym in Einheiten quantifiziert, die sich auf die Menge an Substrat beziehen, die in einer bestimmten Zeit in Produkt umgewandelt wird.

Quantifizierung der Genexpression unter Verwendung von Oligonukleotid-Microarrays

Die beiden Extreme bei der Quantifizierung der Genexpression sind die detaillierte Untersuchung der Expression eines bestimmten Gens, das ein Protein codiert, für das Informationen und Werkzeuge verfügbar sind; und allgemeine Untersuchung der Expression vieler Gene unter Verwendung moderner Methoden, die die gleichzeitige Untersuchung vieler Moleküle ermöglichen. Zu diesen Methoden gehörten Massenspektrometrie (für kleine Metaboliten), zweidimensionale Gelelektrophorese (für Proteine) und Microarrays oder RNAseq (für mRNA). Im Allgemeinen würde man im letzteren Fall die Wirkung eines Mittels oder einer Bedingung auf das gesamte Spektrum der Genexpression untersuchen.

Lassen Sie uns die Microarray-Technologie untersuchen , da dies das Hauptanliegen des Posters ist.

Die Microarray-Technologie misst die relativen Mengen an mRNA.

Die Methodik beinhaltet die Amplifikation einer gemischten mRNA-Spezies durch reverse Transkription zu cDNAs, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert werden. Die cDNA wird basierend auf den Sequenzen der Gene im Organismus an immobilisierte Oligonukleotide hybridisiert, und es wird angenommen, dass die Stärke des Fluoreszenzsignals proportional zur Menge der einzelnen mRNA-Spezies in der Probe ist. Die dem Benutzer bereitgestellten Daten sind jedoch eher die relative Bildintensität innerhalb des Experiments als Einheiten, die es ermöglichen, die tatsächliche Menge an mRNA zu berechnen.

Wie hängen diese relativen Mengen an mRNA mit der Genexpression zusammen?

1. Die relativen Mengen an mRNA sind ein relatives Maß für die Syntheserate von Proteinen (3 in dig.), wenn man davon ausgeht, dass die Syntheserate jedes Proteins ähnlich proportional zur Menge seiner mRNA (a in dig.) ist einschränkend wäre. Dies ist in den meisten Fällen eine vernünftige Annahme, da mRNA schneller abgebaut wird als Protein. (Sie sind kein Maß für die Proteinmenge – b in dig.)

2. Die relativen Mengen an mRNA können nicht als Maß für die Transkriptionsrate einer mRNA von ihrem Gen (1 in dig.) verwendet werden, da der mRNA-Abbau (2 in dig.) einen relativ größeren Effekt auf die stationäre Konzentration von mRNAs hat , und die Tatsache, dass verschiedene mRNAs unterschiedliche Halbwertszeiten haben.

Nachtrag zum Plakat

Ich habe versucht, diese Antwort allgemein zu formulieren, um für mehr Menschen von Nutzen zu sein. Da die Poster keine Biologin ist, hat sie möglicherweise immer noch Schwierigkeiten, den Hintergrund der biologischen Experimente zu verstehen, die die von ihr analysierten Daten generiert haben.

Das interessierende biologische System ist die Genexpression, die die gesamte Reihe von Ereignissen von der Transkription von Genen zu mRNA und ihrer Translation in Proteine ​​umfasst. Hintergrund ist, dass es einige Gene gibt, die unabhängig von physiologischen Gegebenheiten (fast) immer exprimiert werden, weil sie für die Aufrechterhaltung der Struktur und alltäglichen Funktionen der Zelle benötigt werden. Dies wird als konstitutive Expression bezeichnet, Beispiele sind die Expression der Gene für Zytoskelett-Aktine oder ribosomale Proteine. Andere Gene werden nur bei Bedarf exprimiert („eingeschaltet“) (und können als induzierbar bezeichnet werden). Die Frage hier scheint zu sein, ob die Gene für die Enzyme, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, die ganze Zeit (konstitutiv) exprimiert werden, um mit dem normalen "Verschleiß" der DNA fertig zu werden, oder ob ihre Expression nur als Reaktion auf eine bekannte Beleidigung erfolgt DNA schädigen, wie z. B. Gammabestrahlung.

Wie ich bereits erwähnt habe, besteht ein Ansatz, der hier als experimenteller Wissenschaftler übernommen werden kann, darin, die Expression von einem oder zwei gut charakterisierten Proteinen zu untersuchen, von denen bekannt ist, dass sie an der DNA-Reparatur beteiligt sind. Es können jedoch Proteine ​​an diesem Prozess beteiligt sein, die Sie nicht kennen, also die modernen Methoden zur Untersuchung der Expression aller Gene in einem Organismus (wenn die DNA-Sequenz bekannt ist) – Oligonukleotid-Microarrays oder besser RNASeq. Diese Verfahren messen relative Mengen an mRNA in einer Zelle. Dies ist kein Proxy für die Proteinmenge oder die Geschwindigkeit seiner Synthese (der Begriff „Proteinaktivität“ ist bedeutungslos und wird nicht verwendet und sollte nicht verwendet werden), es ist, was es ist , sondern spiegelt auch die Expression der Gene widerdie für die mRNAs kodieren. Keine Expression, keine mRNA.

Man kann sich die Microarray- und RNASeq-Ansätze als Angelexpeditionen vorstellen. Wenn Sie mRNAs finden, die nur vorhanden sind, nachdem die Zelle einen Stimulus oder eine Beleidigung erhalten hat, hat die Expression der mRNA stattgefunden (unabhängig davon, ob die Mengen direkt proportional zur Syntheserate sind oder nicht). Wenn die mRNA synthetisiert wird, können Sie davon ausgehen, dass sie in das Protein übersetzt wird, für das sie kodiert. Im Fall von Gammabestrahlung könnte man davon ausgehen, dass jede mRNA, die eine große Mengenzunahme aufweist, ein Protein kodiert, das am Schutz der Zelle vor der Strahlung beteiligt ist. Dies wird von wissenschaftlichem Interesse sein, insbesondere wenn es nicht das ist, was man erwartet hat.