Trennung von kleineren DNA-Fragmenten und größeren Fragmenten ohne Gelelektrophorese?

Eine Option ist die Verwendung von SPRI-Kügelchen, wie sie von Ampure ( Ampure XP-Kügelchen ) verkauft werden, um DNA-Fragmente nach Größe zu trennen. Durch Anpassen des Verhältnisses von Kügelchen zu Probe können Sie Fragmente bestimmter Längen selektiv binden, indem Sie Fragmente anderer Längen ausschließen, wie im folgenden Bild zu sehen:

Aus diesem Bild können Sie versuchen, ein Perlen-zu-Probe-Verhältnis von 0,7 zu ​​verwenden, um Fragmente unter 200 bp auszuschließen, oder ein Verhältnis zwischen 0,7 und 0,6, um nur die Fragmente darunter zwischen 200 und 250 bp auszuschließen. Der Vorteil von Kügelchen gegenüber einem Gel ist die Zeit, die es braucht. Die Größenauswahl nach Kügelchen dauert nur etwa 10 Minuten, im Vergleich zu vielleicht 30 Minuten oder mehr für ein Gel (einschließlich der Extraktion).

Wie bei jedem molekularbiologischen Verfahren ist es wichtig, es zu testen und sicherzustellen, dass es für Sie funktioniert. Zum Beispiel könnte es eine gute Idee sein, Aliquote Ihrer Proben zu nehmen und die Längen und Ausbeuten zu vergleichen, die Sie aus einer Reihe von Kügelchenkonzentrationen erhalten, und/oder die Ausbeuten zu vergleichen, die Sie durch die Verwendung von Gel und (in diesem Fall) Kügelchen erhalten .

Meiner Meinung nach ist die Geltrennung (mit einem ziemlich hochprozentigen Gel, um die Banden so weit wie möglich zu trennen) und die manuelle Exzision bei weitem die beste Option. Das Problem bei Molekulargewichts-Sperrfiltern besteht darin, dass der von ihnen angegebene Wert (z. B. 5000 Da) eine durchschnittliche Porengröße ist, die nicht exakt ist. Daher endet jeder Versuch, 270 bp von 170 bp Oligos zu trennen, damit, dass einige der kürzeren Konstrukte im Endprodukt landen und einige der längeren Sequenzen im Durchfluss. Auch die Chancen, ein Produkt von der Stange zu finden, das genau Ihren Größenanforderungen entspricht, sind gering. Verwenden Sie diese Art von Kits nur, wenn Sie beispielsweise ein 300-bp-PCR-Produkt von unbenutzten Primern trennen.

Sie könnten eine Art Säulenchromatographie mit einer Größenausschlussmatrix durchführen, aber das ist im Wesentlichen dasselbe wie die Verwendung eines Gels. Der einzige Vorteil ist, dass es skalierbar ist. Wenn Sie also große Mengen an PCR-Produkt zu trennen haben (sagen wir 5 oder 10 ml), wäre es einfacher, eine einzelne Säule zu laufen, als so viele Bahnen in ein Gel zu laden.